為了使基因療法成為更容易獲得和負(fù)擔(dān)得起的治療選擇，工藝強(qiáng)化是增加每批次病毒載體產(chǎn)生的劑量數(shù)量的一種可能策略。當(dāng)與穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系結(jié)合應(yīng)用時(shí)，可以通過(guò)在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中進(jìn)行灌流來(lái)實(shí)現(xiàn)慢病毒載體生產(chǎn)的工藝強(qiáng)化，從而無(wú)需轉(zhuǎn)移質(zhì)粒即可顯著提高細(xì)胞擴(kuò)增和慢病毒載體的生產(chǎn)。切向流深層過(guò)濾用于通過(guò)灌流提高細(xì)胞密度，并允許慢病毒載體與生產(chǎn)細(xì)胞連續(xù)分離，來(lái)實(shí)現(xiàn)強(qiáng)化的慢病毒載體生產(chǎn)。由聚丙烯制成的具有 2 至 4 μm 孔徑的中空纖維深層過(guò)濾器在用于這種強(qiáng)化工藝時(shí)表現(xiàn)出高過(guò)濾能力、延長(zhǎng)的功能壽命以及慢病毒載體與生產(chǎn)細(xì)胞和碎片的有效分離。我們預(yù)計(jì)，使用 200 L 規(guī)模的切向流深層過(guò)濾進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的工藝強(qiáng)化，每批次可針對(duì)需要慢病毒載體的 CAR T 或 TCR 細(xì)胞和基因治療生產(chǎn)約 10,000 劑，后者每劑需要大約 2 × 10^9 轉(zhuǎn)導(dǎo)單元（TU）。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行基因遞送始于 1980 年代，并且一直是一種有用的工具，部分原因是逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠用水皰性口炎病毒囊膜糖蛋白 (VSVg) 進(jìn)行假型化，以增強(qiáng)穩(wěn)定性并提供廣泛的趨向性。慢病毒載體 (LVV) 已成為基因治療的有力工具，因?yàn)樗鼈兛梢杂行У貙⑶安《驹系剿拗骰蚪M中，可以轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞，并且具有低免疫原性。LVV 可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)患者 T 淋巴細(xì)胞以驅(qū)動(dòng) T 細(xì)胞受體 (TCR) 或嵌合抗原受體 (CAR) 基因的表達(dá)，從而治療不同的癌癥。
截至 2022 年初，已完成大約 3,000 項(xiàng)臨床試驗(yàn)，另有 597 項(xiàng)正在進(jìn)行、重復(fù)或即將招募的使用 LLV 的臨床試驗(yàn)，這證明了細(xì)胞和基因治療領(lǐng)域?qū)?LVV 的濃厚興趣。然而，這些療法的成本對(duì)許多潛在患者來(lái)說(shuō)是一個(gè)障礙，部分原因是與 LVV 生產(chǎn)相關(guān)的成本是由一般的工藝產(chǎn)量以及用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染工藝所需的質(zhì)粒 DNA 的高昂成本所引起的。這些生產(chǎn)方面的挑戰(zhàn)不僅會(huì)影響治療的成本，還會(huì)影響生產(chǎn)滿(mǎn)足流行病潛在需求所需的足夠劑量的能力。例如，如果不提高每批次的LVV產(chǎn)量或增加生產(chǎn)批次，開(kāi)發(fā)一種對(duì)大部分肺癌患者既可用又負(fù)擔(dān)得起的細(xì)胞療法是不可行的，2021 年，僅美國(guó)就有約 131,880 人死于肺癌。
成本建模分析表明，通過(guò)使用一次性攪拌罐生物反應(yīng)器 (STR) 以及利用穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系 (SCL)，可以降低 LVV 生產(chǎn)的商品成本，從而消除了 LVV 中對(duì)質(zhì)粒 DNA 的依賴(lài)生產(chǎn)。SCL 的使用提供了通過(guò)在單位生物反應(yīng)器體積中生產(chǎn)更多 LVV 來(lái)提高產(chǎn)量的機(jī)會(huì)，這是通過(guò)灌流系統(tǒng)增加細(xì)胞密度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些技術(shù)的利用有可能降低成本，并減少生產(chǎn)占地，同時(shí)為細(xì)胞和基因療法提供足夠的劑量。值得一提的是，還有其它策略可以增加每批次的生產(chǎn)劑量，例如，提高下游回收率、提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及設(shè)計(jì)旨在提高基因表達(dá)的改良轉(zhuǎn)基因盒。
目前，可以通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)程來(lái)生產(chǎn) LVV，通常通過(guò)使用與聚乙烯亞胺 (PEI) 復(fù)合的四種質(zhì)粒（env、gag-pol、rev 和目的基因）轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。 瞬時(shí)工藝可以快速生產(chǎn)臨床級(jí) LVV；然而，如果在生產(chǎn)中使用 cGMP 級(jí)質(zhì)粒 DNA，這些工藝可能會(huì)變得昂貴。另一方面，雖然 SCL 需要技術(shù)專(zhuān)長(zhǎng)，并且可能需要更長(zhǎng)的開(kāi)發(fā)時(shí)間，但一旦生成它們，就可以用于 LVV 生產(chǎn)，而無(wú)需依賴(lài)質(zhì)粒DNA 和轉(zhuǎn)染。此外，與本研究最相關(guān)的是 SCL 的可放大性?xún)?yōu)勢(shì)。固有穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞可以在不丟失載體基因組的情況下在培養(yǎng)中擴(kuò)增，并使用 Tet-On 系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)，從而消除了生產(chǎn)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的需要。
可以使用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)或懸浮馴化細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn) LVV 的生產(chǎn)（無(wú)論是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染還是 SCL）。貼壁細(xì)胞需要生長(zhǎng)基質(zhì)，以允許粘附和擴(kuò)散。使用貼壁培養(yǎng)的 LVV 可擴(kuò)展生產(chǎn)平臺(tái)包括分層容器（細(xì)胞工廠(chǎng)）、固定床生物反應(yīng)器 (如iCELLis)、中空纖維生物反應(yīng)器 (如Quantum) 以及微載體（如 Fibra-Cel，與無(wú)基質(zhì)的生物反應(yīng)器（如搖擺運(yùn)動(dòng)反應(yīng)器 (WAVE) 或 STR）結(jié)合使用）。懸浮培養(yǎng)通常與 STR 配對(duì)，因?yàn)樗鼈儾皇芟惹傲谐龅南到y(tǒng)基質(zhì)表面積的限制。
Lesh等人的研究結(jié)論是 iCellis (Pall) 固定床生物反應(yīng)器由于可放大性和易于收獲而成為貼壁生產(chǎn)的有利選擇，但請(qǐng)注意，不可能在初始接種后直接檢測(cè)細(xì)胞密度。Powers 等人以 0.15 × 10^5 cells/cm2 接種 iCellis，通過(guò)在 2.65 m2 生物反應(yīng)器上使用 Aber Futura 生物量探針進(jìn)行間接測(cè)量，估計(jì)收獲細(xì)胞密度約為 6.8 × 10^5 cells/cm2。 Pall 提供的 iCellis 系統(tǒng)高達(dá)至 500 m2；使用 Powers 等人測(cè)量的收獲密度，這可以支持高達(dá) 3.4 × 10^12 cells。就細(xì)胞密度而言，這大約是支持懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的 500 L STR 的兩倍，當(dāng)以 3 × 10^6 cells/mL 的收獲密度進(jìn)行批次模式操作時(shí)，這將產(chǎn)生 1.5 × 10^12 cells/batch。每個(gè)系統(tǒng)都存在優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn) - 貼壁培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)中的 LVV 輸出、大體積收獲材料的純度、易用性、成本和生產(chǎn)占地 - 但顯然這兩種系統(tǒng)都提供了支持大量細(xì)胞以及從而產(chǎn)生大量 LVV的能力；Powers等人估計(jì)使用 300 m2低壓實(shí)系統(tǒng)運(yùn)行一次 iCellis 可以從一個(gè)批次中生產(chǎn) 6,490 劑用于 X 連鎖嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷 (X-SCID) 的 LVV，假設(shè)產(chǎn)量與他們的 2.65 m2小規(guī)模模型相當(dāng)。
灌流 - 通過(guò)營(yíng)養(yǎng)物添加和副產(chǎn)物去除而實(shí)現(xiàn)連續(xù)的液體交換 - 是考慮用于 LVV 生產(chǎn)的生物反應(yīng)器選項(xiàng)的另一個(gè)因素。 iCellis 系統(tǒng)本質(zhì)上是一種灌流系統(tǒng)，因?yàn)榧?xì)胞會(huì)粘附在固定床膜上，并且能夠在不干擾細(xì)胞的情況下置換培養(yǎng)基。然而，尚不清楚 iCellis 系統(tǒng)是否可以通過(guò)提高接種后的培養(yǎng)基置換率來(lái)支持比之前提到的更高的細(xì)胞密度。中空纖維膜 (HF) 已與 STR 和搖擺運(yùn)動(dòng)生物反應(yīng)器一起使用，以置換培養(yǎng)基，并支持比通常在批次或補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)的更高的細(xì)胞密度。這些膜可以在切向流過(guò)濾 (TFF) 或交替式切向流過(guò)濾 (ATF) 模式下運(yùn)行，并已證明能夠成功地生成高達(dá) 2.14 × 10^8 cells/mL 的細(xì)胞培養(yǎng)。
灌流在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的好處可以在多個(gè)不同的生產(chǎn)領(lǐng)域中找到。在生物制藥生產(chǎn)過(guò)程中，灌流已用于制備高細(xì)胞密度種子庫(kù)，可在需要接種生物反應(yīng)器時(shí)冷凍和解凍，從而減少整體種子擴(kuò)增時(shí)間。此外，灌流可用于 N-1 生物反應(yīng)器，這減少了生產(chǎn)（N 級(jí)）生物反應(yīng)器接種前所需的反應(yīng)器體積。 N-1 生物反應(yīng)器中的灌流還可以允許以更高的細(xì)胞密度進(jìn)行接種，從而在工廠(chǎng)中節(jié)省更多的時(shí)間。最后，可以在 N 級(jí)反應(yīng)器中使用灌流來(lái)提高產(chǎn)品產(chǎn)量。 單克隆抗體 (mAb)、 腺病毒載體和 LVV 的產(chǎn)量增加已通過(guò)利用灌流系統(tǒng)與封閉系統(tǒng)生物反應(yīng)器的結(jié)合得到了證明。
ATF 技術(shù)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中實(shí)現(xiàn) STR 灌流的既定選擇。目前可通過(guò) Repligen 獲得，ATF 由許多封裝在圓柱形外殼中的管狀中空纖維過(guò)濾器組成。過(guò)濾器孔徑大小將決定系統(tǒng)的分類(lèi)是超濾 (50 kDa) 還是微濾 (0.2 或 0.45 μm)。過(guò)濾器連接生物反應(yīng)器內(nèi)的導(dǎo)管和系統(tǒng)底部的隔膜泵。流量的方向和速率由控制隔膜中空氣壓力的控制器決定，從而使細(xì)胞培養(yǎng)物交替向上沖程進(jìn)入生物反應(yīng)器，然后向下沖程返回設(shè)備；這種交替的切向流通過(guò)去除過(guò)濾器表面積聚的雜質(zhì)來(lái)促進(jìn)自清潔。濾液管線(xiàn)位于包裹的中空纖維束的外側(cè)。從反應(yīng)器中移除的速率要么根據(jù)預(yù)定的灌流速率設(shè)置為常數(shù)，由細(xì)胞特異性灌流速率 (CSPR) 決定，要么設(shè)置為在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中保持恒定的重量，同時(shí)以恒定的速度添加培養(yǎng)基，即由 CSPR 確定。
一種正在探索的新過(guò)濾技術(shù)是 Repligen 的切向流深層過(guò)濾 (TFDF)，與 ATF 相比有幾個(gè)關(guān)鍵區(qū)別。 TFDF 是管狀聚丙烯過(guò)濾器，壁厚約為 5 mm。相比之下，ATF 中空纖維聚醚砜膜的厚度約為 0.075-0.2 mm。 TFDF管腔由各向同性材料制成；結(jié)合其厚度，該過(guò)濾器允許延長(zhǎng)曲折的通道路徑，直徑約為 2–4 μm，顆粒必須穿過(guò)這些通道才能進(jìn)入濾液端。 ATF 中空纖維是一種各向異性材料，用作絕對(duì)截止過(guò)濾器，50 kDa，0.2 μm，或最大的產(chǎn)品，0.45 μm。深層過(guò)濾與 TFF 的結(jié)合使 TFDF 具有更高的過(guò)濾容量，同時(shí)避免生物產(chǎn)物滯留在過(guò)濾器內(nèi)。 TFDF 系統(tǒng)在沒(méi)有交替流動(dòng)的情況下運(yùn)行：低剪切泵通過(guò)生物反應(yīng)器內(nèi)的兩個(gè)導(dǎo)管在一個(gè)方向上通過(guò)過(guò)濾器循環(huán)培養(yǎng)物，并且濾出液同樣通過(guò)蠕動(dòng)泵基于恒定速率從過(guò)濾器外殼中去除，或通過(guò)重量控制自動(dòng)調(diào)節(jié)。
兩種灌流技術(shù)之間的材料差異使它們可以應(yīng)用于不同的模式和不同的產(chǎn)品類(lèi)型。當(dāng)使用超濾時(shí)，單克隆抗體，如 IgG1， 可以被 ATF 中空纖維截留，但如果系統(tǒng)切換為使用微濾中空纖維，產(chǎn)品可以在濾出液中連續(xù)收集。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，微濾 ATF 膜會(huì)截留 LVV（數(shù)據(jù)未顯示），后者直徑約為 100–120 nm，而 TFDF 明顯較大的孔結(jié)構(gòu)已被證明允許 LVV 自由進(jìn)入濾出液。
Oxford Biomedica 已經(jīng)證明，TFDF 技術(shù)可用于從 HEK293T 細(xì)胞中分離LVV，并可擴(kuò)大規(guī)模，以進(jìn)行批量過(guò)濾。初步實(shí)驗(yàn)表明，可以使用單個(gè) 55 cm2 TFDF 過(guò)濾器和單個(gè)生物反應(yīng)器，進(jìn)行多次 5 L 批次收獲，方法是在初始收獲后將培養(yǎng)物重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。他們還將這項(xiàng)技術(shù)與市售深層過(guò)濾器進(jìn)行了比較，結(jié)果表明 TFDF 收獲物的產(chǎn)量更高。最后，他們成功地將他們的工藝從 5 L STR 擴(kuò)大到了 50 L STR。
TFDF 的優(yōu)勢(shì)在于其在灌流支持下從高細(xì)胞密度培養(yǎng)物中進(jìn)行連續(xù)收獲的潛在應(yīng)用。前面的例子有效地展示了 HEK293T 與 LVV 的分離；然而，該系統(tǒng)用于 1 小時(shí)的批次收獲，而不是連續(xù)分離。很可能在收獲之前沒(méi)有使用灌流，并且不清楚收獲密度是多少，因?yàn)樗鼈兾垂_(kāi)。我們?cè)噲D通過(guò)灌流和連續(xù)收獲，來(lái)測(cè)試該過(guò)濾器對(duì)工藝強(qiáng)化的有用性。
我們報(bào)告了在灌流系統(tǒng)中以高細(xì)胞密度（>20 × 10^6 cells/mL）從 SCL 連續(xù)生產(chǎn)和收獲 LVV，這是通過(guò)使用 TFDF 實(shí)現(xiàn)的。在這項(xiàng)研究中，過(guò)濾器最初在低細(xì)胞密度 (LCD) 下進(jìn)行評(píng)估，以驗(yàn)證 Oxford Biomedica 報(bào)告的發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種使用 ATF 技術(shù)的灌流工藝，該工藝將 LVV 與生產(chǎn)細(xì)胞一起大量濃縮，并將收獲限制為在誘導(dǎo)后 48 小時(shí) (hpi) 進(jìn)行的單批次收獲。使用 TFDF 實(shí)現(xiàn)的灌流允許從高細(xì)胞密度培養(yǎng)物中連續(xù)收獲和分離 LVV。因此，從生物反應(yīng)器中收集 LVV 成功地實(shí)現(xiàn)了高達(dá) 96 hpi，這是使用 ATF 技術(shù)通過(guò)單批次收獲實(shí)現(xiàn)的生產(chǎn)時(shí)間的兩倍。
詳細(xì)實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果，請(qǐng)參考原文。
圖 1 低細(xì)胞密度 TFDF 收獲結(jié)果
圖 2 所有運(yùn)行的活細(xì)胞密度 (VCD) 和活性 vs. 運(yùn)行的時(shí)間（天）。
圖 3 使用 TFDF 的高細(xì)胞密度灌流：濁度和跨膜壓。
圖 4 使用 TFDF 的高細(xì)胞密度灌流（僅運(yùn)行 2）：顆粒濃度和滲透率百分比。
圖 5 使用 FlowCam 8000 測(cè)量并取自 TFDF 運(yùn)行 2 的濾出液和生物反應(yīng)器樣品的顆粒直方圖
圖 6 針對(duì)反應(yīng)器、在線(xiàn)濾出液和原液袋樣品，高細(xì)胞密度 (HCD) p24 (pg/mL)、ddPCR 感染滴度 (TU/mL)、宿主細(xì)胞蛋白 (HCP) (ng/mL) 和雙鏈 DNA (ng/mL) vs. 時(shí)間（天）。
圖 7 使用 TFDF 的高細(xì)胞密度灌流：估計(jì)的慢病毒載體產(chǎn)量。
結(jié)論
TFDF 膜的初步評(píng)估作為概念證明進(jìn)行，旨在使用單個(gè) 2 L 生物反應(yīng)器回答幾個(gè)問(wèn)題。主要重點(diǎn)是了解和量化通過(guò)過(guò)濾器的 LVV 產(chǎn)量，確定典型工藝通量下的膜載量，并評(píng)估從單個(gè)生物反應(yīng)器進(jìn)行多次收獲的可能性。為此，我們使用尺寸過(guò)小的過(guò)濾器 (3 cm2) 來(lái)達(dá)到基于最大負(fù)載的過(guò)程終點(diǎn)。
先前的研究報(bào)告說(shuō)，使用 55 cm2 TFDF 膜和 5 L 生物反應(yīng)器進(jìn)行的兩批次收獲具有良好的 LVV 產(chǎn)量，細(xì)胞密度和 LVV 滴度未公開(kāi)。最初選擇這些條件是因?yàn)樗鼈兇砹俗罴压に噮?shù)，導(dǎo)致收獲時(shí)間略低于 1 小時(shí)，每次收獲的通量為 909 L/m2。 在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們報(bào)告了高過(guò)濾器載量是由于 3 cm2 過(guò)濾器的尺寸配備 2 L 生物反應(yīng)器。兩批收獲的總和超過(guò) 11,000 L/m2，48 hpi 收獲約為 6,170 L/m2，96 hpi 收獲約為 5,200 L/m2。盡管在 96 hpi 收獲時(shí) TMP 接近 5 psi，表明膜逐漸污染，但第二次收獲成功完成，否則正常流量深層過(guò)濾將無(wú)法實(shí)現(xiàn)。在實(shí)踐中，可以通過(guò)選擇更大的單位體積過(guò)濾面積來(lái)避免這些高壓；但是，在擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模、以降低生產(chǎn)工廠(chǎng)的成本和設(shè)備尺寸時(shí)，了解過(guò)濾器載量至關(guān)重要。
LVV 產(chǎn)量的評(píng)估也令人鼓舞。對(duì)于 48 hpi 的收獲，確定了幾乎完全的 LVV 回收率，這是對(duì)市售深層過(guò)濾器的改進(jìn)，通常獲得的澄清率在 75% 和 90% 之間。雖然對(duì)于 96-hpi 收獲，發(fā)現(xiàn)濾膜發(fā)生了一些損失，考慮到膜被推到其最大過(guò)濾載量，這并不完全令人驚訝。如果增加每個(gè)收獲體積的過(guò)濾面積，我們將再次期望提高第二次收獲的產(chǎn)量。此外，我們決定在 48 hpi 收獲后斷開(kāi)過(guò)濾器并將其內(nèi)容物排入反應(yīng)器，并在開(kāi)始 96 hpi 收獲之前重新灌流過(guò)濾器。在觀(guān)察過(guò)濾器在后面的灌流實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行的能力后，如果重復(fù)多批次收獲，我們可能會(huì)決定不對(duì)膜進(jìn)行排液和重新灌流。或者，我們可以讓膜在 48 hpi 到 96 hpi 的條件下再循環(huán)，而不運(yùn)行濾液泵，然后在準(zhǔn)備第二次收獲時(shí)簡(jiǎn)單地打開(kāi)泵。我們認(rèn)為這可能是一種更好的方法，因?yàn)榍邢蛄鲗?duì)膜的自清潔作用有益；此外，該操作的勞動(dòng)力要求較少。需要額外的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定擴(kuò)大具有多批次收獲的工藝的好處。
對(duì)于 LCD 細(xì)胞培養(yǎng)（例如，非灌流批次工藝），TFDF 似乎是將 LVV 從宿主生產(chǎn)細(xì)胞中分離出來(lái)的有效膜。雖然我們故意使 3 cm2的過(guò)濾器過(guò)載，但更實(shí)用的批次工藝可能會(huì)以 2-2.5 的安全系數(shù)運(yùn)行，并嘗試將總工藝時(shí)間保持在 1-2 小時(shí)左右。如果在這些限制范圍內(nèi)開(kāi)發(fā)一種工藝，可以使用 50 cm2 的膜來(lái)培養(yǎng) 10 L，450 cm2 來(lái)培養(yǎng) 100 L，2,100 cm2 來(lái)培養(yǎng) 500 L，過(guò)濾面積分別Repligen 提供的實(shí)驗(yàn)室、中試和生產(chǎn)規(guī)模 KrosFlo 產(chǎn)品匹配。理論上，使用他們最大的 6,000 cm2 過(guò)濾器可以在 2,000 L 下執(zhí)行兩次收獲過(guò)程，但根據(jù)我們的結(jié)果，這會(huì)將工藝時(shí)間推至大約 3 小時(shí)，并使用約 1.3 的低安全系數(shù)。然而，應(yīng)根據(jù)每個(gè)生產(chǎn)細(xì)胞系的具體情況進(jìn)行詳細(xì)評(píng)估，以確定可接受的公差范圍。
在最初的實(shí)驗(yàn)證實(shí)之后，我們?cè)噲D評(píng)估 TFDF，以便使用我們的 SCL 實(shí)現(xiàn)灌流，以獲得傳統(tǒng)批次工藝形式的強(qiáng)化版本。觀(guān)察到的處理量表明過(guò)濾器也可能適用于此應(yīng)用程序并支持更高的細(xì)胞密度培養(yǎng)。過(guò)去的實(shí)驗(yàn)是利用 0.2 和 0.45 μm ATF 中空纖維進(jìn)行灌流；然而，在濾液中只有微量的 LVV（p24 和 ddPCR 小于 1%）。使用 ATF 的灌流時(shí)，LVV 必須在誘導(dǎo)后一段時(shí)間后以批次形式從生產(chǎn)細(xì)胞中分離出來(lái)；因此，ATF 的目的是促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)增到比沒(méi)有灌流時(shí)可能達(dá)到的密度高得多的密度。通過(guò)使用 TFDF，我們預(yù)計(jì)除了能夠在誘導(dǎo)前將培養(yǎng)擴(kuò)增到更高密度外，還能夠從生產(chǎn)細(xì)胞中連續(xù)分離 LVV。
TFDF 實(shí)際上可以通過(guò)灌流將培養(yǎng)擴(kuò)增到更高的密度，并且與 ATF 中空纖維相比，似乎沒(méi)有任何區(qū)別。誘導(dǎo)前，培養(yǎng)平均達(dá)到 37.1 × 10^6 cells/mL，活性≥95%；在我們的案例中，可能可以實(shí)現(xiàn)更高的密度，但每天需要更多的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。我們的工藝限制在每天大約 3 個(gè)罐體積（VVD)，以避免對(duì)該工藝的潛在放大版本提出不切實(shí)際的培養(yǎng)基要求。因此，進(jìn)一步放大將面臨必需營(yíng)養(yǎng)素缺乏的風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)影響生產(chǎn)細(xì)胞的 LVV 生產(chǎn)。
我們著手通過(guò)量化濾液和反應(yīng)器濁度、TMP 以及粒徑和濃度來(lái)表征過(guò)濾器的性能。所有技術(shù)都表明 TFDF 膜可以有效地將 LVV 從生產(chǎn)細(xì)胞和細(xì)胞碎片中分離出來(lái)。如圖 S1 所示，除了運(yùn)行 1 在線(xiàn)濾液樣品外，濾液中的濁度始終小于測(cè)量的反應(yīng)器濁度的 2%。對(duì)于運(yùn)行 1 ，我們強(qiáng)烈懷疑在提供的單向閥采樣端口（位于 TFDF 過(guò)濾器外殼的濾液側(cè)）上使用注射器快速抽取采樣的行為導(dǎo)致人為高于設(shè)定點(diǎn)的通量（90 LMH）。在誘導(dǎo)后 2、3 和 4 天，運(yùn)行 1 的在線(xiàn)濾液濁度均高于任何批次收獲濁度。如果在線(xiàn)濁度實(shí)際上具有代表性，我們會(huì)預(yù)期批次收獲液中會(huì)有更大的濁度。出于這個(gè)原因，我們建議不要使用注射器端口進(jìn)行在線(xiàn)采樣，并使用 Y 型連接器收集到無(wú)菌樣品瓶中，就像我們第二次和第三次 TFDF 運(yùn)行所做的那樣?？偟膩?lái)說(shuō)，濁度降低是一致的，并且在將濁度突破定義為濾液濁度相對(duì)于反應(yīng)器濁度的增加時(shí)，直到誘導(dǎo)后 4 天都沒(méi)有觀(guān)察到突破。
圖 3C 中的低 TMP 和此測(cè)量值的線(xiàn)性增加還支持我們觀(guān)察到發(fā)生了最小的顆粒突破。對(duì)于突破事件，我們可能期望 TMP 過(guò)渡到非線(xiàn)性階段，表明過(guò)濾器內(nèi)有明顯堵塞，這通常會(huì)導(dǎo)致更高比例的顆粒突破。相反，TMP 的快速下降可能表明過(guò)濾器受損，不再能夠截留大顆粒。深層過(guò)濾提供了一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，與片式過(guò)濾器相比，它通?？梢蕴峁└叩娜萘浚?yàn)樗试S顆粒被捕獲在其通道內(nèi)，而不會(huì)完全阻塞通過(guò)同一通道的液體流動(dòng)。 TFDF，正如其恰當(dāng)?shù)拿Q(chēng)所示，結(jié)合了 TFF 的這一優(yōu)勢(shì)，有助于剪切膜表面，以最大限度地減少過(guò)濾器內(nèi)的顆粒沉積。因此，TMP 逐漸線(xiàn)性增加，誘導(dǎo)后最多 4 天的所有運(yùn)行均不超過(guò) 0.5 psi (>8,000 L/m2)，這是 LVV 與細(xì)胞碎片成功分離的積極跡象。
我們最后一種表征過(guò)濾器的方法是量化反應(yīng)器中的顆粒濃度和大小，并使用液流成像直接觀(guān)察濾液，據(jù)稱(chēng)其成像范圍為 2–50 μm（盡管某些顆粒在 <2 μm 處被檢測(cè)到）。我們發(fā)現(xiàn)，即使是 FlowCam 可檢測(cè)到的最小顆粒也能被 TFDF 有效阻擋（圖 4 和 5），并且在誘導(dǎo)后長(zhǎng)達(dá) 4 天的時(shí)間里，觀(guān)察到的濾液顆粒尺寸沒(méi)有顯著增加。這一觀(guān)察再次支持我們使用 TFDF 膜從細(xì)胞碎片中有效分離 LVV 的結(jié)論。
到目前為止，在我們的討論中，我們強(qiáng)調(diào)了支持細(xì)胞和細(xì)胞碎片截留在膜的回流側(cè)的數(shù)據(jù)。為了總結(jié) LVV 從生產(chǎn)細(xì)胞和碎片的有效分離，我們?cè)趫D 6 和圖 7 中通過(guò) ddPCR 量化了 p24 濃度和感染性滴度，以證明實(shí)現(xiàn)了高 LVV 回收率。首先，在圖 6 中，很明顯，在相對(duì)于反應(yīng)器的濾液中測(cè)量到了可比的分析標(biāo)記；我們?cè)趫D 7 中的產(chǎn)量計(jì)算量化了這些結(jié)果，并得出結(jié)論，在我們的收獲液中獲得了幾乎完全回收的 LVV。因此，我們已經(jīng)證明 TFDF 膜在從生產(chǎn)細(xì)胞和反應(yīng)器中存在的絕大多數(shù)碎片中分離 LVV 方面表現(xiàn)良好。
該工藝的一個(gè)觀(guān)察到的缺點(diǎn)是 LVV 的感染性隨著時(shí)間的推移在誘導(dǎo)后明顯降低；然而，這個(gè)問(wèn)題與 TFDF 過(guò)濾器無(wú)關(guān)，可以歸因于 SCL。已知使用 VSVg 假型化的 LVV 對(duì)生產(chǎn)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。如圖 6 所示，感染滴度和感染性均出現(xiàn)明顯下降。前者在 LVV 生產(chǎn)的拐點(diǎn)后減少，大約 48 hpi，而后者從誘導(dǎo)開(kāi)始減少。對(duì)于我們的生產(chǎn)細(xì)胞系，從誘導(dǎo)后第1-2天、第2-3天以及第3-4天，收獲的總TU平均為 42.5%、37.4% 和 17.2%。如果放大具有這些特征的工藝，則應(yīng)執(zhí)行成本效益分析，以確定收獲窗口以及第 3 天之后的收獲是否有利。此外，需要進(jìn)一步表征，以評(píng)估從誘導(dǎo)后很長(zhǎng)時(shí)間收獲的純化 LVV 產(chǎn)品是否具有足以用于患者的質(zhì)量屬性，特別是相對(duì)于誘導(dǎo)后直接收獲的具有更高感染性的產(chǎn)品。具有較低感染性的餾分可能需要更高的感染復(fù)數(shù) (MOI)，從而需要更高的細(xì)胞和基因治療劑量。我們想提一下，我們懷疑通過(guò)增強(qiáng)生產(chǎn)培養(yǎng)基、載體構(gòu)建設(shè)計(jì)和假型化以及克隆選擇對(duì)上游工藝的進(jìn)一步優(yōu)化可能會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)細(xì)胞系得到改進(jìn)，從而增強(qiáng)在誘導(dǎo)后延長(zhǎng)的生產(chǎn)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生具有更一致感染性的 LVV 的能力。
我們對(duì)由 ATF 或 TFDF 支持的強(qiáng)化灌流工藝與標(biāo)準(zhǔn)批次工藝進(jìn)行的比較表明，使用當(dāng)前可用的過(guò)濾技術(shù)可以獲得顯著的生產(chǎn)收益。如表 1 所示，與非灌流批次生產(chǎn)相比，ATF 或 TFDF 工藝都允許將生產(chǎn)細(xì)胞的密度提高一個(gè)數(shù)量級(jí)，并且可以獲得幾乎相同的 LVV 產(chǎn)量增加。擁有 SCL 可以使這些強(qiáng)化工藝變得可行并最終具有成本效益；由于不需要轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，因此只需通過(guò)從生長(zhǎng)培養(yǎng)基切換到生產(chǎn)培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)培養(yǎng)，以啟動(dòng) SCL 的基因表達(dá)，從而生產(chǎn)細(xì)胞的LVV組裝和出芽。 TFDF 提供了從生產(chǎn)細(xì)胞中連續(xù)分離 LVV 的額外好處，與 ATF 強(qiáng)化工藝相比，這導(dǎo)致每批次的 TU 增加近 2 倍。 TFDF 強(qiáng)化的這種生產(chǎn)收益是一個(gè)好處，因?yàn)椴恍枰K止培養(yǎng)來(lái)分離 LVV，而這是 ATF 工藝所必需的。
在比較 TFDF 和 ATF 強(qiáng)化工藝時(shí)，應(yīng)強(qiáng)調(diào)進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。雖然我們強(qiáng)調(diào)可以通過(guò)使用 TFDF 擴(kuò)增誘導(dǎo)后細(xì)胞的策略來(lái)提高產(chǎn)量，但另一個(gè)好處是不需要二次分離步驟：TFDF 用作促進(jìn)灌流的工具，同時(shí)用作第一步分離。對(duì)于 ATF ，由于 LVV 截留在生產(chǎn)細(xì)胞的回流液中，因此需要二次單元操作來(lái)執(zhí)行類(lèi)似的分離。例如，離心或深層過(guò)濾步驟可用于此分離；然而，這是一筆巨大的成本，并且會(huì)在生產(chǎn)環(huán)境中占用額外的空間。 ATF 和離心機(jī)配對(duì)可以可行地允許從灌流強(qiáng)化反應(yīng)器中進(jìn)行多次收獲；然而，還需要進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)來(lái)確定 ATF 如何在多次收獲中保持潤(rùn)濕狀態(tài)和功能，以及如何將細(xì)胞沉淀從離心機(jī)返回到生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)基再懸浮。
雖然上述優(yōu)點(diǎn)適用于 TFDF，但它并非沒(méi)有缺點(diǎn)。主要缺點(diǎn)是單位體積輸出，其中包含 LVV。我們每天生產(chǎn)了大約 3 VVD 的濾液，如果收獲 2 天或 3 天的濾液，則分別相當(dāng)于 6 或 9 個(gè)罐的總體積。雖然 ATF 需要與 TFDF 相同數(shù)量的培養(yǎng)基，但在收獲時(shí)，含有 LVV 的上清液只是一個(gè)罐體積。因此，它們的后續(xù)下游工藝看起來(lái)幾乎等同于非灌流批次工藝，而 TFDF 形式需要某種形式的體積濃縮或?qū)V液收集在相對(duì)于生物反應(yīng)器體積更大的儲(chǔ)罐中。前者將是首選，因?yàn)榭紤]將 TFDF 用于連續(xù)生產(chǎn)的人可能會(huì)對(duì)從批次生產(chǎn)切換到連續(xù)生產(chǎn)時(shí)通常實(shí)現(xiàn)的占地減少感興趣。
為了進(jìn)一步闡述這一點(diǎn)，可以圍繞 TFDF 設(shè)計(jì)一個(gè)真正的連續(xù)工藝，以進(jìn)一步減少生產(chǎn)占地，并與批次相比，更快地從生物反應(yīng)器中分離和純化 LVV。這提供了提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量的潛力，因?yàn)橐阎?LVV 對(duì)溫度敏感，因此不能長(zhǎng)時(shí)間保存。單程 TFF (SPTFF) 是一種選項(xiàng)，可用于將 TFDF 濾液的體積減少到后續(xù)純化步驟的實(shí)用水平。另一種選擇是多柱層析法 (MCC)；在這種情況下，TFDF 濾液可以通過(guò)預(yù)過(guò)濾器并連續(xù)上樣到在上樣、洗脫和再生階段之間交替的柱上。這兩種選擇都需要對(duì) LVV 生產(chǎn)進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估；然而，它們目前對(duì)生物制藥生產(chǎn)都特別有吸引力，以提高生產(chǎn)率，并減少占地和成本；因此，這些技術(shù)的前景可擴(kuò)展到細(xì)胞和基因治療以及 LVV 的生產(chǎn)。
用于 LVV 生產(chǎn)的灌流強(qiáng)化工藝的發(fā)展引入了為大量患者群體提供足夠 LVV 劑量的可能性。如果我們做出幾個(gè)假設(shè)，我們就可以開(kāi)始估計(jì)可以以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的劑量數(shù)。這些初始假設(shè)包括適度的 20% 下游收率，ddPCR 的總 TU 大約是功能滴度的 5 倍，并且 2 L 規(guī)模的工藝可以有效地?cái)U(kuò)大到 200 L。如果我們進(jìn)一步假設(shè)所需的劑量對(duì)于假設(shè)的 TCR 和 CAR-T 療法，每位患者是 2 × 10^9 TU，對(duì)于假設(shè)的造血干細(xì)胞 (HSC) 基因療法，是 2 × 10^10 TU，則200-L 批次、ATF灌流和 TFDF 灌流將分別產(chǎn)生 900、12,000 和 24,000 劑，用于 TCR 和 CAR-T 療法，而 HSC 基因療法則低一個(gè)數(shù)量級(jí)。雖然每種單獨(dú)的療法都將取決于經(jīng)驗(yàn)確定的 MOI，并且每個(gè)工藝的產(chǎn)量都會(huì)有所不同，但這個(gè)例子證明了在不久的將來(lái)使用 LVV 進(jìn)行細(xì)胞和基因療法治療大量患者群體的可能性。
