來自REGENXBIO Inc.的研究人員近日發表了題為“Advances in Recombinant Adeno-Associated Virus Production for Gene Therapy”的文章。本文為原文內容簡介，詳細內容，請參考原文。
重組腺相關病毒 (rAAV) 是用于遞送遺傳物質、以進行基因治療的主要載體，但其低產量和產品質量導致高生產成本，目前，這仍然是該領域的主要挑戰。在本文中，我們總結了常用平臺的最新進展，包括 HEK293、桿狀病毒、HSV 和基于 HeLa 的 rAAV 生產方法。文章詳細介紹了提高產量和產品質量的每種方法和策略的優勢和主要挑戰。
近年來，基于 rAAV 的基因治療獲得了很多關注，因為它具有幾個理想的屬性，包括缺乏致病性和低免疫原性。基于 rAAV 的載體靶向分裂和非分裂細胞，包括視網膜、肝臟、心臟、肌肉和中樞神經系統 (CNS)， 允許治療基因的長期表達。迄今為止，已針對各種疾病進行了 200 多項臨床試驗，例如血友病 A 和 B、帕金森病、濕性年齡相關性黃斑變性、粘多糖貯積癥 (MPS)、巴頓病等。2012 年，開發用于治療反向脂蛋白脂肪酶缺乏癥 (LPLD) 的脂基因tiparvovec 成為歐洲第一個獲批的基因治療藥物。之后，另外2種基因治療產品獲得了美國食品藥品監督管理局（FDA）的批準，包括 2017 年批準 voretigene neparvovec ，用于治療 Leber 先天性黑蒙，以及2019年批準onasemnogene abeparvovec，用于治療脊髓肌肉萎縮 (SMA)。
盡管基于 rAAV 的基因療法的臨床試驗取得了成功，但由于產量低以及某些疾病適應癥的高劑量需求，高生產成本仍然是基因治療領域的瓶頸。Onasemnogene abeparvovec 單劑量治療費用為 210 萬美元，是美國市場上最昂貴的藥物之一。另一個例子是，治療 X 連鎖肌管肌病 (XLMTM) 需要每公斤 10^14 載體基因組 (vg/kg) ，每個患者至少需要 10^15 vg。盡管最近的工藝和技術發展已將產量提高到 10^11 至 10^12 vg/L，并降低了商品成本，上游產量仍不足以滿足XLMTM等疾病的大劑量需求。
腺相關病毒生物學
野生型腺相關病毒 (AAV) 是 Atchison 等人于 1965 年偶然發現的，即電子顯微鏡觀察到了腺病毒制劑中 包含的25 nm 小污染性顆粒。它需要腺病毒進行復制，后來被分類為無囊膜病毒的細小病毒科。野生型 AAV 包含一個 4.7 kb 的單鏈 DNA 基因組，跨越2個主要開放閱讀框 (ORF)，兩側是兩個 T 形反向末端重復序列 (ITR)（圖 1）。反向末端重復具有復制蛋白結合元件 (RBE) 和末端解析位點 (TRS)，其參與復制、衣殼中的基因組包裝和長期細胞內持久性。第1個開放閱讀框 (rep) 包含 P5 和 P19 啟動子，并通過可變剪接編碼4種復制蛋白（根據分子量，命名為 Rep78、Rep68、Rep52、和 Rep40 后的分子量）（圖 1）。Rep78 和 Rep68 的表達受 P5 啟動子的調節。它們是 DNA 復制、位點特異性整合、基因表達調控以及從宿主基因組中切除所必需的。P19 啟動子調控 Rep52 和 Rep40 的表達。Rep52 和 Rep40 都具有 3' 到 5' 的解旋酶活性，對 AAV 基因組包裝很重要。第2個開放閱讀框（帽）包含 P40，1個控制3個衣殼蛋白亞基（即 VP1、VP2和VP3）表達的啟動子，后者分子量分別為 87、72 和 62 kDa。VP1、VP2 和 VP3 的羧基末端蛋白質序列相同。
圖1. 野生型AAV2基因組組織。AAV2基因組是單鏈DNA (4.7 kb)，有2個主要的開放閱讀框，兩側是T形倒置末端重復序列。P5和P19啟動子驅動兩個rep轉錄本的轉錄，這2個轉錄本經過選擇性剪接 (曲線)，導致2個大的rep蛋白 (Rep78和Rep68) 和2個小的rep蛋白 (Rep52和Rep40) 的表達。P40啟動子控制cap轉錄本的轉錄和表達。可選的剪接 (曲線)，使用非傳統的開始密碼子，和移位的開放閱讀框導致5種不同的蛋白質的表達。這些蛋白包括3種衣殼蛋白 (VP1、VP2和VP3)、組裝激活蛋白 (AAP) 和膜關聯蛋白 (MAAP)。p81啟動子轉錄并控制基因X的表達，該基因可能參與AAV的復制。RBE：Rep結合元件；ITR：反向末端重復；Ploy (A)：聚腺苷酸化信號；TRS，終端解析點。
衣殼蛋白以 1:1:10 的比例 (VP1:VP2:VP3) 由2個交替剪接的 mRNA 產生，組裝由 60 個病毒蛋白亞基組成的衣殼。來自 P40 啟動子轉錄物的次要剪接 RNA 變體包含 VP1 翻譯起始密碼子 (AUG)，這解釋了其與 VP3 相比較低的表達水平。雖然主要剪接 RNA 變體包含 VP2 和 VP3 的翻譯起始位點，但后者的翻譯是從傳統的 AUG 起始密碼子開始的，而前者是從一個非常規的 ACG 起始位點產生的，該位點經常被跳過并導致 VP2 表達降低（圖 1）。VP1 的 N 末端還含有以磷脂酶 A2 (PLA2) 為代表的酶活性，這是 AAV 從內體逃逸所必需的，并包含核定位信號 (NLS)。帽區域還包含一個移碼開放閱讀框，編碼組裝激活蛋白 (AAP) 的非常規密碼子 CUG，在 VP 亞基蛋白轉運至核仁區室和衣殼組裝過程中，該蛋白在大多數 AAV 血清型中起重要作用。據報道，AAP 蛋白與衣殼蛋白的保守 C 末端相互作用，并作為組裝支架發揮作用。在帽區域還鑒定了另外2個開放閱讀框，編碼蛋白 X 和膜相關輔助蛋白 (MAAP)。雖然它們在 AAV 生物學中的確切功能仍不清楚，但它們可能分別參與增強 AAV 的復制和分泌（圖 1）。rAAV 僅包含來自野生型病毒的 ITR，而復制和衣殼化的基本元素（rep 和 cap）被目的基因的表達盒替換。
當前的重組腺相關病毒 (rAAV) 生產平臺
本文將討論5個主要生產平臺，在 rAAV 質量、產量、實施速度和可靠的可放大性方面，每種方法都有自己的優點和缺點。最廣泛使用的平臺之一是用于 rAAV 生產的 HEK293 細胞瞬時轉染。其它常用的平臺包括桿狀病毒表達載體系統 (BEVS) 和基于 HeLa 細胞的系統，主要是因為它們可直接進行大規模生產。另一個眾所周知的系統基于單純皰疹病毒 (HSV)，它也可為 rAAV 生產提供直接的可放大性。最后一個平臺涉及在無輔助病毒系統中使用 HEK293 細胞或其它細胞類型進行穩定的細胞系開發，而不在生產中使用腺病毒、BEVS、HeLa 或 HSV；這已成為最近的熱門話題，并取得了實質性進展。
為了克服當前 rAAV 生產平臺面臨的瓶頸，多個研究小組已經探索了使用替代宿主進行 rAAV 生產的可行性，例如E.Coli和釀酒酵母，其擁有完善的蛋白質生產平臺，商品成本低。最近的一項研究表明，AAV2 VP3 衣殼亞基可在E.Coli中表達并成功組裝，具有與通過HEK293 瞬時轉染工藝產生的 rAAV2 相似的物理和生化特性。由于缺乏適當的蛋白質折疊和翻譯后修飾, 其它研究小組探索使用釀酒酵母作為另一種生產 rAAV 的替代方法，并簡化下游工藝。使用編碼 Rep78、Rep52、衣殼 VP1、VP2、VP3 和 AAP 的4種質粒轉化酵母細胞，研究小組觀察了到 rAAV 的正確組裝，但與更發達的 Sf9/桿狀病毒系統產生的 rAAV 相比，完整顆粒百分比和感染性較低。酵母系統的未來研究重點是識別參與衣殼組裝、AAV 復制和包裝的酵母宿主因子，這將有助于開發更好的酵母系統，實現更具可放大性和成本效益的AAV生產。
基于 HEK293 的 rAAV 生產系統
rAAV 最初是通過瞬時轉染3種質粒生產，其攜帶在 HEK293 或 HEK293T 宿主細胞中組裝 rAAV 的必需基因，細胞穩定表達腺病毒 E1A 和 E1B 基因的轉染 DNA，支持 AAV 復制。雖然與 HEK293 細胞相比， HEK293T 細胞具有更快的生長速率以及更好的可轉染性，且rAAV 產量更高，但SV40 T 抗原腫瘤蛋白的存在會導致安全風險。來自 E1A 的編碼蛋白通過反式激活 P5 和 P19 啟動子來增加 rep 表達。除了編碼 rep 和 cap 的第2個質粒和包含2側含有2個倒置表達盒的第3個質粒之外，在1個質粒上提供其余的必要腺病毒輔助基因（E4、E2A 和病毒相關 (VA) RNA）末端重復序列 (ITR)，防止 rAAV 生產過程中的腺病毒污染（圖 2A）。
圖2. 基于HEK293的rAAV生產平臺。每個平臺的簡化rAAV生產工作流程，展示rAAV生產中涉及的每個基本步驟。(A) 三質粒轉染。(B) 兩質粒轉染。(C) 基于四環素的自沉默腺病毒 (TESSA載體)。總結了每種工藝的優點和挑戰。GOI：目的基因；ITR，反向末端重復。
A）三質粒轉染：優勢：1- 最常用于工業，2- GMP質粒生產時間短，3- 臨床實施速度快，4- 無需腺病毒；挑戰：1- 商品生產成本高，2- 規模放大挑戰，3- 質粒材料的一致GMP生產。
B）兩質粒轉染：優勢：1- GMP質粒生產成本降低，2 - 臨床實施速度快，3- 無需腺病毒；挑戰：1- 規模放大，2- 質粒材料的一致GMP生產。
C）TESSA載體：優勢：1- 可規模放大，2- 提高rAAV產量；挑戰：1- 需針對每個項目制備TESSA載體，延長了時間線，2-需要從生產批次中去除殘留的腺病毒。
傳統上，貼壁 HEK293 細胞被用于 rAAV 生產的三質粒轉染方法，這為初步臨床試驗產生了足夠的 rAAV。行業已經開發了一些新方法，以從貼壁 HEK293 細胞轉移到無血清懸浮培養。這種馴化工作規避了貼壁瞬時轉染技術規模放大的挑戰。
腺相關病毒是一種依賴型細小病毒，需要多種宿主因子和輔助病毒提供的必要基因才能復制。除腺病毒外，還鑒定和表征了幾種輔助病毒，以支持增殖，例如針對哺乳動物細胞生產的單純皰疹病毒、牛痘病毒、針對昆蟲細胞生產的桿狀病毒。Wang 等人發現，人博卡病毒 1 (HBoV1) 是 AAV2 復制的新型輔助病毒，AAV2 復制的最低要求包括 HBoV1、NP1 和 NS4 非結構蛋白，以及病毒長鏈非編碼 RNA (BocaSR)。同一團隊的一項研究表明，將人博卡病毒輔助基因（NP1 和 NS4）與腺病毒輔助必要基因（E4、E2A 和 VA RNA）相結合，在三質粒瞬時轉染方法中，獲得的產量大約是單獨使用腺病毒輔助質粒的2倍.
三質粒轉染系統已經非常成熟，通常用于臨床和商業化生產。幾個研究小組試圖引入雙質粒系統，以縮短生產 GMP 產品所需的時間，并降低產品成本，同時簡化瞬時轉染工藝（圖 2B）。Grimm 等人引入了第1個雙質粒表達系統，他們在其中設計了一種新的包裝/輔助質粒 pDG，以包括 AAV 復制、衣殼形成和輔助功能所需的rep、cap、E4、E2A 和 VA RNA 基因。在該質粒中，p5 啟動子被誘導型小鼠乳腺腫瘤病毒 (MMTV) 啟動子取代，以削弱 Rep 蛋白表達。用 pDG 質粒和轉基因載體質粒共轉染細胞足以產生 AAV。作者報告說，這種雙質粒系統產生的 AAV 滴度比傳統的三質粒轉染系統高 10 倍。使用類似的方法中，Tang 等人對 pDG 質粒的骨架進行了進一步修改，以創建包括rAAV 生產所需的基本腺病毒輔助基因之外，包含 AAV rep 和 cap 的 pQT 包裝質粒。他們使用不同的 AAV 血清型（包括 AAV1、AAV5、AAV8 和 AAV9），將 pQT 系統與傳統三質粒系統進行了比較，發現 pQT 系統的功能與三質粒轉染系統相似，并且對于GMP生產，在速度和成本效益方面更靈活。
最近，Su等人介紹了一種適合規模放大的、自衰減腺病毒系統，與傳統的瞬時轉染方法相比，該系統使一系列血清型的 rAAV 產量提高了 10 到 30 倍（圖 2C）。在這個系統中，研究人員能夠通過打開/關閉負責 rAAV 生產和腺病毒結構蛋白表達的輔助功能的早期和晚期時間階段，從而控制輔助腺病毒的生命周期。這是通過插入四環素操縱子 TetO 來設計腺病毒主要晚期啟動子 (MLP) 而實現的，TetO 可以用主要晚期啟動子表達的 TetR 阻遏物來抑制。這種設計創造了一個負反饋回路來調節腺病毒結構基因的表達，這些基因由多西環素存在與否控制。rAAV 生產是通過用基于四環素的自沉默腺病毒（TESSA 載體）感染 HEK293 細胞來實現的，提供具有輔助功能的早期基因表達，其中穩定摻入側翼為 ITR 的 AAV 轉基因，同時提供在同一區域含有 AAV rep和cap基因的第2個 TESSA 載體。盡管該系統顯示出比傳統的三質粒轉染更高的 rAAV 產量并且可以規模放大，但仍然有低水平的腺病毒污染。這可能是由于強力霉素調節啟動子的固有滲漏性。此外，研究已經表明，在沒有腺病毒主要晚期啟動子 (MLP) 的情況下，一種腺病毒纖維蛋白以非常低的水平從隱蔽啟動子表達。在下游工藝過程中可以完全清除殘留的腺病毒污染，以確保安全。
新技術將進一步實現瞬時轉染的可放大性并提高 rAAV 質量，例如使用無質粒瞬時轉染和納米質粒平臺。除了實施無質粒平臺外，其他研究人員還在探索支持高轉染效率以及在大規模生物反應器中獲得高生產率的新型轉染試劑。
原文：P.Liu, A.Mayer, Advances in Recombinant Adeno-Associated Virus Production for Gene Therapy. American Pharmaceutical Review, 2022.
