在創(chuàng)新藥等生物制藥的過(guò)程中，建立菌種庫(kù)的意義在于利用菌種庫(kù)系統(tǒng)進(jìn)行充分的質(zhì)量檢測(cè)并以此最大程度的控制和減少污染和菌種的性質(zhì)改變。科研人員為了達(dá)到菌種庫(kù)建立的目的，在建立菌種庫(kù)時(shí)需要菌種庫(kù)具備足夠數(shù)量的菌種和維持菌種的均質(zhì)性，用以確保研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中所用的菌種的來(lái)源的一致性。
關(guān)鍵詞
三級(jí)種子庫(kù)
菌種庫(kù)的構(gòu)建
什么是三級(jí)菌種庫(kù)？
菌種建庫(kù)建立的三級(jí)種子庫(kù)包括
1. 原始種子庫(kù)(pre-master cell bank/research cell bank, PCB/RCB）
2. 主代種子庫(kù)(master cell bank,MCB)：從原始種子批傳代、擴(kuò)增后保存的為主種子庫(kù)
3. 工作種子庫(kù)(working cell bank,WCB)：從主種子庫(kù)進(jìn)行批傳代、擴(kuò)增后保存即為工作種子庫(kù)
每批種子庫(kù)都應(yīng)按規(guī)程的要求進(jìn)行保管、檢定和使用。為了保障生物制品的安全性，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)，確定其達(dá)到相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求。
三級(jí)菌種庫(kù)不僅僅是簡(jiǎn)單的將菌種按照傳代或者特性分為三個(gè)級(jí)別，而是對(duì)于菌種的保存與運(yùn)用設(shè)置了三種基礎(chǔ)的質(zhì)量和程序要求，以確保菌種在長(zhǎng)期的、大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用中的穩(wěn)定性和可溯源性等。
主菌種庫(kù)與工作菌種庫(kù)的區(qū)別
主菌種庫(kù)是從PCB分離出來(lái)的單菌落，然后對(duì)該單菌落經(jīng)過(guò)傳代，增殖后混成均質(zhì)菌懸液，定量分裝于凍存管，并采取適當(dāng)方法保存的用于制備工作菌種庫(kù)的菌種來(lái)源。
工作菌種庫(kù)是由主菌種庫(kù)再傳代增殖后，混成均質(zhì)菌懸液，定量分裝于凍存管，并采取適當(dāng)方法保存的用于商業(yè)化生產(chǎn)的菌種來(lái)源。發(fā)酵所用的菌種除了常規(guī)的檢測(cè)指標(biāo)，如菌落形態(tài)外觀(guān)、生產(chǎn)能力和其他生化指標(biāo)外，還需要檢測(cè)：如污染菌檢査（微生物、真菌、支原體的檢測(cè)分析）、組分檢測(cè)、孢子量檢測(cè)等才能被作為工作菌種庫(kù)保存和使用。
在實(shí)際運(yùn)用過(guò)程中，部分企業(yè)將主菌種庫(kù)和工作菌種庫(kù)簡(jiǎn)單的以傳代次數(shù)和保存條件進(jìn)行劃分。
這種區(qū)分方法是絕對(duì)錯(cuò)誤的，在短期生產(chǎn)或無(wú)后續(xù)研究的情況下或許不會(huì)出現(xiàn)缺漏，但只要進(jìn)入長(zhǎng)期、大規(guī)模生產(chǎn)階段，這種區(qū)分方法就帶來(lái)工作菌種的質(zhì)量和性質(zhì)不穩(wěn)定等諸多問(wèn)題。出現(xiàn)以上問(wèn)題的主要原因是沒(méi)有理解主菌種庫(kù)與工作菌種庫(kù)之間的關(guān)系。
1、來(lái)源的不同，MCB來(lái)源于初始菌株的單菌落，如誘變后的高產(chǎn)菌種，在經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性驗(yàn)證后，從這一高產(chǎn)單菌落中進(jìn)行增殖獲得的一系列的菌懸液。WCB是從MCB擴(kuò)增而來(lái)，但并不出自于MCB的單菌落。
2、對(duì)法規(guī)理解偏差，如果每年的使用量特別小，當(dāng)MCB足以支持生產(chǎn)需要時(shí)，便沒(méi)有必要設(shè)置WCB。
3、MCB和WCB在工藝和質(zhì)量放行的標(biāo)準(zhǔn)上存在不同。一般MCB比WCB在使用和標(biāo)準(zhǔn)上更嚴(yán)格。
什么樣的菌種才可以作為工作菌種？
微生物發(fā)酵產(chǎn)品通常會(huì)采用化學(xué)、物理誘變方法或者基因技術(shù)對(duì)微生物菌種進(jìn)行選育或基因改造，得到一個(gè)更高產(chǎn)能效率的新菌種。得到的高產(chǎn)菌株，如果經(jīng)過(guò)生產(chǎn)能力，傳代穩(wěn)定性，組分檢測(cè)、孢子量等檢測(cè)指標(biāo)，尤其是雜質(zhì)指紋比較后，確定沒(méi)有問(wèn)題后就可以建立新的主菌種庫(kù)，而用于商業(yè)化生產(chǎn)。
菌種庫(kù)的構(gòu)建
菌種庫(kù)構(gòu)建過(guò)程主要需要注意以下幾個(gè)方面
1. 建庫(kù)用菌種的溯源性
2. 菌種建庫(kù)過(guò)程合規(guī)性
3. 建庫(kù)菌種的檢定要求
4. 菌種傳代穩(wěn)定性研究
一、溯源性
為保證菌種的可溯源性菌種庫(kù)構(gòu)建資料要求具備基因、載體和宿主細(xì)胞的來(lái)源及改造過(guò)程。其來(lái)源明確清晰，切實(shí)可靠，其演化歷史也必須清楚。
目的基因：
為確保目的基因的可溯源性菌種庫(kù)必須確定其來(lái)源、設(shè)計(jì)和改造過(guò)程，并且要求來(lái)源明確清晰，歷史演化過(guò)程清楚。
表達(dá)載體：
為保證表達(dá)載體的可溯源性菌種庫(kù)構(gòu)建資料要求具備表達(dá)載體的來(lái)源、名稱(chēng)、結(jié)構(gòu)等信息，說(shuō)明重組質(zhì)粒的構(gòu)建和檢定過(guò)程。載體來(lái)源應(yīng)當(dāng)清楚，明確其出處以及可靠性。
宿主細(xì)胞：
宿主細(xì)胞的來(lái)源要明確，提供其名稱(chēng)、生物學(xué)特性，檢定結(jié)果等信息。
二、菌種建庫(kù)過(guò)程合規(guī)性
建庫(kù)流程：依照法規(guī)規(guī)定，從篩選到的高表達(dá)菌株單克隆經(jīng)反復(fù)純化擴(kuò)增驗(yàn)證后，凍存于-80℃，即為原始種子庫(kù)。取一只原始種子，復(fù)蘇后擴(kuò)增驗(yàn)證，然后混合一定濃度的甘油后在-80℃凍存，即為主種子庫(kù)。取主種子進(jìn)行復(fù)蘇后擴(kuò)增驗(yàn)證，然后混合一定濃度的甘油后在-80℃凍存，即為工作種子庫(kù)。所有的種子都要嚴(yán)格記好株名、批號(hào)、編號(hào)、凍存日期、分裝數(shù)量、放置位置及取用記錄等。
①需在GMP體系完成建庫(kù)工作，建庫(kù)流程、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過(guò)程都要形成SOP管理文件。
②保證均質(zhì)性，如果是使用了多個(gè)容器培養(yǎng)，分裝前需要有合適的方法充分混勻。
③為保證工作種子庫(kù)、主種子庫(kù)與原始種子庫(kù)的生物學(xué)特性一致，建庫(kù)過(guò)程中不得有單克隆挑選和菌種篩選的行為。
星耀小TIP：
GMP標(biāo)準(zhǔn)（藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范）是為保證藥品在規(guī)定的質(zhì)量下持續(xù)生產(chǎn)的體系。它是為把藥品生產(chǎn)過(guò)程中的不合格的危險(xiǎn)降低到最小而訂立的。GMP包含方方面面的要求，從廠(chǎng)房到地面、設(shè)備、人員和培訓(xùn)、衛(wèi)生、空氣和水的純化、生產(chǎn)和文件。
三、建庫(kù)菌種的檢定要求
①菌落形態(tài)及抗生素抗性，考察菌種在含與不含抗生素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)及抗生素抗性。
②生化反應(yīng)，考察工程菌是否具有典型的大腸桿菌生化反應(yīng)。
③染色鏡檢，考察工程菌菌體形態(tài)及革蘭氏類(lèi)別。
④重組表達(dá)載體酶切檢定，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒酶切后DNA片段大小符合理論值。
⑤基因序列測(cè)序，驗(yàn)證重組表達(dá)載體上的目的基因序列的正確性。
⑥電鏡觀(guān)察，通過(guò)電鏡觀(guān)察菌體形態(tài)，支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染情況。
⑦菌體目的蛋白表達(dá)檢定，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)分析重組質(zhì)粒是否表達(dá)目的蛋白。
⑧菌體表達(dá)蛋白免疫原性檢查，通過(guò)Western-blot檢測(cè)分析重組質(zhì)粒表達(dá)的重組蛋白是否具有正確的免疫原性。
《中國(guó)藥典》三部中規(guī)定了細(xì)胞基質(zhì)的質(zhì)量要求，包括：細(xì)胞鑒別（種屬、株及專(zhuān)屬特性）；外源因子污染檢查（包括病毒性及非病毒性?xún)?nèi)外源因子）；成瘤性及致瘤性檢測(cè)；染色體核型；均一性及穩(wěn)定性等。
四、菌種傳代穩(wěn)定性研究
根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)要求，種子庫(kù)要開(kāi)展傳代穩(wěn)定性研究，明確限傳代次數(shù)，使用壽命，評(píng)估是否能夠滿(mǎn)足未來(lái)商業(yè)化生產(chǎn)需求。在開(kāi)展傳代穩(wěn)定性研究時(shí)應(yīng)在模擬實(shí)際的生產(chǎn)條件下開(kāi)展。通常對(duì)重組質(zhì)粒穩(wěn)定性和表達(dá)穩(wěn)定性研究的方法為：對(duì)種子庫(kù)菌種多代次培養(yǎng)，通過(guò)雙酶切檢測(cè)與菌體PCR檢測(cè)，確定傳代50次后質(zhì)粒是否丟失。通過(guò)對(duì)傳代50代的菌液誘導(dǎo)培養(yǎng)后，對(duì)菌體表達(dá)的目的蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，確定傳代后的表達(dá)穩(wěn)定性。
總結(jié)
綜上所述，三級(jí)菌種庫(kù)的建立不僅僅是為了為菌種的保存和追溯提供切實(shí)的依據(jù)，而且是在GMP審查以及IND申報(bào)時(shí)所必需的數(shù)據(jù)來(lái)源。因此在建立三級(jí)菌種庫(kù)之時(shí)所需要考慮的不僅包括菌種庫(kù)本身的基本要求，而且要把IND申報(bào)的要求考慮在內(nèi)。在保證符合國(guó)家關(guān)于菌種庫(kù)建立的要求之外，符合IND申報(bào)和GMP體系的要求。
